响应面设计优化脂溶性茶多酚合成工艺的研究

多酚是茶叶中最重要的活性成分,被认为是最优秀的天然抗氧化剂之一。茶多酚是近年来国内外研究的热点。研究表明,它具有抗癌、抗衰老、抗辐射、降血糖、降血脂等一系列生物活性。这些活性得益于其优异的抗氧化能力。茶多酚多羟基的结构决定了其亲水性。然而,由于细胞膜的磷脂双层结构,茶多酚在生物体内的生物利用度不高,难以达到靶向效果。茶多酚直接加入油相中,会引起结块和沉淀,难以充分发挥其抗氧化作用。这限制了茶多酚作为油脂抗氧化剂的应用。目前,食品工业主要使用合成脂溶性抗氧化剂,如bha、BHT、pg和TBHQ等。这些合成抗氧化剂具有一定的直接或潜在毒性、致癌和致畸作用。因此,如何通过修改来做出呢?在保持蜡优良抗氧化能力的同时,具有蜡的溶解性是一个重要的研究课题。目前,已有关于茶多酚甲基化修饰的报道。然而,尽管甲基化修饰可以降低亲水性,但它不能真正使茶多酚脂溶性。从化学结构来看,碳链的长度与其脂溶性直接相关。因此,本实验试图通过连接长碳链来改变茶多酚的分子结构,改变其亲水性,通过酰化法制备脂溶性茶多酚,并通过优化条件掌握制备ltp的关键参数,研究ltp在油体系中的抗氧化等性质。

1材料和方法

1.1实验材料

<茶多酚,浙江东方茶叶科技有限公司<多酚含量95%,EGCG 38%);成都格雷西亚试剂有限公司没食子酸乙酯;菜籽油、茶籽油、新昌益生茶业科技有限公司;浙江衢州鸣丰化工有限公司脂肪酸酰氯(> 95%);2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)、叔丁基氢醌(TBHQ)、乙酸乙酯、氯仿、无水乙醇、冰醋酸、盐酸、三乙醇胺、碳酸钠X、无水硫酸钠、硫代硫酸钠、可溶性淀粉、重铬酸钾、碘化钾、硫酸亚铁、酒石酸钾钠都是分析纯的。1.2主要乐器

A1204电子天平;DK-S26电热恒温水浴锅;2X98-1旋转式蒸发器;SHB-ⅲ-A循环水式多用途真空泵;紫外线-2102电脑DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱。1.3实验方法1.3.1水合制备LTP称取精制茶酚10.00克,测量乙酸乙酯100毫升,加入三口瓶中,搅拌加热至规定温度,加入人碱性催化剂碳酸氢钠,然后滴加人脂肪酸酰氯。反应完成后,使用30ML稀盐酸,然后使用蒸馏水洗涤催化剂和未反应的茶多酚三次。水层分离后,加入一定量的脱水剂,过滤,减压浓缩有机相,低温真空蒸发乙酸乙酯,得到化学改性产物LTP。

在预实验的基础上,本实验选择原料配比(相同茶多酚用量为10,008,改变酰氯用量,范围为15-458),反应温度为40-60℃,反应时间为5-9h。设计专家软件中的中心组合用于优化实验设计。以油脂的氧化抑制率为评价指标。响应面优化实验的因子水平如所示。

1 . 3 . 2 LTP含量的测定

LTP与三乙醇胺水溶液中的亚铁离子形成紫蓝色络合物。紫蓝色络合物在540 mm处有最大吸收峰,吸光度值可用分光光度法测定,并与标准没食子酸乙酯比较,得到LTP含量。在0 ~ 100毫克/100毫升没食子酸乙酯浓度范围内绘制标准曲线,线性回归方程为Y=0.0032×0,0577,r?=0.9831时,吸光度与浓度之间的线性关系良好,可用作标准曲线。

准确称取不同工艺条件下合成的200mg8 LTP样品,用无水乙醇溶解,定容至100ml。将1.0毫升样品溶液吸收到25毫升比色管中,加入1毫升三乙醇胺水溶液(1:1),混合均匀,加入5毫升酒石酸亚铁溶液,加水定容至25毫升,以试剂空白为参照,在540毫米波长下测试吸光度值。

1.3.3测定油中ltp的抗氧化活性

将不同工艺条件下合成的LTP加入样品浓度为200^ppm.的油菜籽原油中在供应箱中60℃加热会促进油的氧化。每2天测量一次过氧化值,并使用不含任何添加剂的油菜籽原油作为对照。

碘量法测定Pov。油脂中的过氧化物在无水酸条件下1-定量氧化成12。碘和淀粉能形成蓝色络合物,反应灵敏,微量碘存在时能呈现明显的颜色,在紫外区有明显的吸收特性。通过与标准工作系列碘溶液的比较来定量。在12时,在0-200微克/30毫升的浓度范围内绘制标准曲线。碘含量与吸光度之间的线性回归方程为y=1.4438A 100,6797,R=0.9931。准确称取约0.01-0.02克的试油样品,在带塞子的30ML试管中同时进行平行试验和空白试验,加入2 ml氯仿-冰醋酸溶液、0.2ML碘化钾饱和碱溶液,盖好摇匀30秒,在暗处反应3分钟。取出后立即用水稀释并加入1.0毫升1%淀粉溶液,在585纳米测量吸光度。根据吸光度和标准曲线计算碘生成量,并计算样品过氧化值随加热时间的延长而逐渐增加。以第5天不同LTP样品对脂质过氧化的抑制率作为响应面优化提取工艺的评价指标。

2结果与分析

2.1酰化合成LTP样品的收率和含量分析

根据响应面设计的20个反应条件下,合成样品的重量和样品的LTP百分比含量如表2所示。分析后,样品重量与LTP百分比含量呈显著负相关,相关系数达到0.86。初步研究发现,[LTP百分含量]并不代表其在油脂中的抗氧化效果,即其LTP含量不高,但在油脂中抗氧化效果良好。由于其目前测定方法的局限性,它显示出未反应的酚羟基的量,高含量仅意味着未反应的羟基的量很大。相反,从实验结果来看,对于几组具有高LTP含量的样品,如1、3、5、7、9等。加入油中,油溶性效果差。原因是脂肪酸酰氯的量少,参与反应的多酚基团少,酯化反应不充分,导致产品LTP含量高,脂溶性差。因此,只有在保证产品油溶性和减少酚羟基反应次数的条件下,才能提高其在油中的抗氧化效果。2.2通过响应面优化酰化来确定制备LTP的最佳反应条件酰基氯的量、反应温度、温度和时间的相互作用、酰基氯量的平方和反应温度的平方对油脂对LTP合成的抗氧化抑制率有显著影响(p <0.05)。影响的顺序为温度、酰氯的量、时间与温度的相互作用、温度的平方、酰氯量的平方和时间对提取率没有显著影响。2.2.3萃取产率响应面各种因素之间的相互作用分析

2.2.1模型适应性分析

使用统计分析软件设计专家分析实验结果,得到反应过程中的油氧化抑制率(Y)、氯量(X1)和反应温度(x2)。反应时间之间的二次多元回归模型(X3):

Y(%)=-149.733 102,0098 x 104.6943 x 204.4965 x 3-0.0087 x2x 3-0.0170 x1x 3-0.0808 x2x 3-0.0211 x1-0.0360 x2-0.0206 x3

该模型的方差分析结果见表3。模型中的P值<0.0001,表明回归方程是线性的,失配值为0.0976(0.05),失配不显著,表明回归方程拟合良好。决策系数(r)和调整系数(adj.r)分别为0.9580和0.9203,具有良好的一致性,表明了模型的准确性和适用性。

2.2.2不同因素对油脂合成LTP抗氧化抑制率的影响

固定反应时间和酰氯用量,响应值随温度升高先升高后降低,在55℃达到最大值。当温度较低时,茶多酚与脂肪酸酰氯的反应能力随着温度的升高而逐渐增加,油脂的抗氧化活性随着合成LTP含量的增加而增加。当温度过高时,氧化副反应发生得更重,导致更多酚羟基损失和更低的抗氧化活性。在固定的反应温度下,随着酰氯用量的增加,响应值先增大后减小,在35g左右达到最高值。低反应量时响应值的变化比高反应量时更显著。

固定反应温度和氯气用量,响应值随时间变化不大,时间对油脂氧化的抑制率没有显著影响。在固定的反应时间内,随着酰氯用量的增加,响应值先增大后减小。当温度一定时,在一定范围内,可以通过增加酰氯的量来缩短反应时间,但是不能通过延长反应时间来减少酰氯的量。

温度和时间的相互作用达到了显著的水平。酰氯的量是固定的。低温下,随着反应时间的延长,响应值呈平缓上升趋势。然而,在较高温度下,响应值随时间的增加呈下降趋势。原因可能是在较低的温度下,茶多酚氧化较少,反应时间延长,能有效地将茶多酚与酰氯结合,油脂氧化抑制率高。在过高的温度下,茶多酚会发生氧化副反应,导致LTP含量降低,抑制率降低。在短反应时间内,响应值先增加,然后随着温度的升高呈现平缓的趋势。当温度上升到大约55℃时,它达到最高。当反应时间较长时,随着温度的升高,反应时间先增加后减少。

通过响应面分析和设计专家软件,LTP的最佳合成艺为:茶多酚与酰氯的质量比为1:3.5,反应温度为55℃,反应时间为5 h,在此条件下,三个平行验证实验的平均抑油率为23.9%。与软件估算值24.2%基本一致,表明响应面优化工艺条件是可行的。

3讨论与结论

虽然分子改性制备脂溶性低温肽的研究已有多年,但还没有成熟的工业化生产技术。目前,茶多酚中儿茶素结构修饰的报道包括酯化、甲基化、冷却、糖苷修饰等衍生化,特别是抗过敏和抗细胞毒素中的甲基化是近年来国际研究的热点,这在一定程度上可以提高儿茶素的生物利用度,但接枝基团的短碳链导致油溶性差,不能提高油脂的抗脂质过氧化作用。脂肪酰化改性是目前研究比较成熟的改性技术。通过合理控制反应时间、温度和物料比,可以调节酰化酚羟基的数量,使改性产物在油体系中具有一定的抗氧化活性。通过响应面优化设计,得到了茶多酚与酰氯的质量比为1:3.5,反应温度为55℃,反应时间为5 h的最佳工艺条件。实验结果表明,茶多酚在油脂中具有良好的溶解性,在油脂中具有显著的抗氧化作用。其抗氧化活性略低于三丁基锡化合物,但优于合成抗氧化剂。这表明采用中和法引入长碳链可以很好地改变茶多酚的亲水特性。制备的LTP不仅具有脂溶性的特点,而且具有优异的抗氧化性能,在油脂体系中作为脂溶性抗氧化剂具有应用前景。此外,LTP的结构及其分子机制有待进一步研究。

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